Analisi Genetiche e Genomiche

ANALISI GENETICHE E GENOMICHE

Lauree Magistrali in: Biologia Applicata alla Biomedicina, Biologia Molecolare e Cellulare, Biotecnologie Molecolari e Industriali

Il corso si tiene in presenza (le registrazioni delle lezioni sono comunque scaricabili da questa pagina).

AULA VIRTUALE (TEAMS)

ISCRIZIONE AGLI ESAMI (LINK DI ATENEO)

MODALITA’ DI ESAME E RISULTATI DELLE PROVE SCRITTE

Informazioni generali sul corso.

Attenzione: leggere attentamente quanto segue.

1) Libri di testo consigliati:	"Genetica molecolare umana ", by Tom Strachan & Andrew P. Read (Zanichelli)	"Introduzione alla Genomica", by Greg Gibson & Spencer Muse (Zanichelli)	Dispensa (ZIP FILE, RAR FILE)

2) Tipologia di lezioni:	Le lezioni sono di tipo frontale. Non sono previsti laboratori.	I 3 CFU del Professor Marangoni consistono in lezioni pratiche. Si richiede di portare il proprio PC portatile per seguire quanto verra’ richiesto.
3) Altro materiale utile:	Tutto il materiale utile si puo' trovare scaricabile da questo sito.
4) Il programma del corso:	Il programma del corso e' riportato contestualmente al calendario sottostante	Gli appelli successivi al 01/01 saranno incentrati sul programma attuale del corso. Gli studenti che avessero frequentato gli a.a. precedenti dovranno necessariamente aggiornare la propria preparazione (a meno di richiedere di sostenere l’esame direttamente con la docente precedente, Prof. Ombretta Melaiu).	Normalmente il programma di studio evolve lentamente di anno in anno. E' pertanto garantita una altissima compatibilita' tra programmi distanti entro i 3 anni.
5) I ricevimenti:	Non esiste un orario specifico di ricevimento. Occorre prenotare un appuntamento col docente all'indirizzo: stefano.landi@unipi.it
6) L'esame, prova scritta:	E' prevista una prova scritta della durata di due ore.	Segui questo link per LE DATE DEGLI APPELLI, L' ISCRIZIONE E I RISULTATI DELLE PROVE SCRITTE.	Per visionare le prove scritte occorre richiedere un appuntamento inviando una posta elettronica La valutazione verra’ mantenuta per 12 mesi.
L'esame, prova orale opzionale:	E' possibile sostenere anche una prova orale facoltativa. Questa puo' essere sostenuta in qualsiasi momento dopo la correzione della prova scritta (anche fuori dal periodo delle date degli appelli). Per accedere alla prova orale basta prendere un appuntamento inviando una e-mail all'indirizzo: stefano.landi@unipi.it	La prova orale fornisce la possibilita' di perfezionare la propria valutazione dello scritto fino ad un massimo di 1 punto A SALIRE, qualora la prova orale sia migliore dello scritto, o A SCENDERE, qualora si evidenzino lacune non emerse nello scritto o incapacita’ di capire i propri errori. Il voto finale risulta dalla media matematica con la valutazione del Prof. Marangoni.	CON LA PUBBLICAZIONE DEI RISULTATI DI ESAME VIENE ANCHE AFFISSA LA DATA PER LA VERBALIZZAZIONE. DATO CHE LA VALUTAZIONE VIENE MANTENUTA PER MOLTO TEMPO, SARA’ POSSIBILE VERBALIZZARE ANCHE IN UN SECONDO MOMENTO SE UNO FOSSE IMPOSSIBILITATO A VENIRE IL GIORNO RICHIESTO DAL DOCENTE.
7) Consiglio:	Il corso di una laurea magistrale prevede varie puntualizzazioni e arricchimenti rispetto a quanto presente sui libri di testo. Si raccomanda molto vivamente di integrare lo studio seguendo attivamente le lezioni. 1) possibilita' di scaricare le diapositive del corso e una bozza di dispensa 2) orario di ricevimento definibile di volta in volta previo appuntamento col docente 3) possibilita' di Scaricare gli esami precedenti
8) Cose da NON fare all'esame (in presenza):	All'esame (se in presenza) ci si presenta con 1) FOGLIO PER LA BRUTTA COPIA 2) CALCOLATRICE, 3) DOCUMENTO DI IDENTITA', 4) PENNA (BLU O NERA). 5) Computer Portatile (con carica di almeno 2 h e collegamento alla rete WiFi per accedere a GoogleForms)	La consegna forzata della prova scritta al punto in cui essa si trova scatta nel momento in cui si e' sorpresi a copiare da compagno o da appunti o tramite utilizzo di altri mezzi di comunicazione.
9) Domande frequenti o di interesse generale ricevute tramite e-mail:	Seguire questo link: le FAQ (frequently asked questions) del corso.

CALENDARIO PREVISTO PER L’ANNO 2021-2022

Data		Ora	Aula	Ore	Ore cumulate	Argomento	SLIDES	AUDIO VIDEO RECORDINGS	Link interattivi

23/09	GIOV	8.30-10	Polo San Rossore Aula D1	2		Questa lezione sara’ tenuta dal Prof. Roberto Marangoni che introdurra’ il suo modulo.
24/09	Ven	8.30-10	Polo Nobili Aula B	2		Questa lezione sara’ tenuta dal Prof. Roberto Marangoni.
30/09	GIOV	8.30-10	Polo San Rossore Aula D1	2	2	Introduction to the course. Refreshing the basics of Genetics	Diapositive 1	.REC.
1/10	Ven	8.30-10	Polo Nobili Aula B	2	4	Types of polymorphisms in the genomes. Minisatellites, microsatellites. DNA fingerprinting, Instability of microsatellites. The Slippage-misalignment model. Neurodisorders caused by aberrant expansion of triplet microsatellites. SNPs e INS/DELs.	Diapositive 2	.REC.
7/10	GIOV	8.30-10	Polo San Rossore Aula D1	2	6	Discovery methods: Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP). High-resolution melting (HRM). Sanger’s sequencing reaction. Genotyping: DOT BLOT. Genotyping by RFLP (restriction fragment length polymorphism) e PCR-RFLP, ASO-PCR (o ARMS-PCR), OLA (Oligonucleotide Ligation Assay), MALDI-TOF, TaqMan Allelic Discrimination Assay.		.REC.	Video on Real Time qPCR.
8/10	Ven	8.30-10	Polo Nobili Aula B	2	8	Microarrays for genotyping: the Single Base Extension (general principle). Illumina® BeadArray. Microarrays for genotyping: hybridization with Affymetrix A short tour in dbSNPs, gnomAD, UCSC Genome Browser, the most used databases for browsing the genetic variations. Segmental Duplications (mandatory and polymorphic). Mechanisms of formation: unequal crossing-over, whole-genome duplications. chromosomal rearrangements.		.REC.	Link a dbSNP, gnomAD, e UCSC Genome Browser
14/10	GIOV	8.30-10	Polo San Rossore Aula D1			Questa lezione sara’ tenuta dal Prof. Roberto Marangoni
15/10	Ven	8.30-10	Polo Nobili Aula B	2	10	Copy number variations (CNVs). The loci of CYP2D6 GSTM1 and GSTT1 as an example of mandatory or polymorphic duplications in the human genome. The example of CYP2D6 in the metabolism of antidepressants and other drugs. The analysis of CNVs by PCR+ gel electrophoresis, by MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification, also called Multiplex Oligonucleotide Ligation Assay), by TaqMan assay (Real-time quantitative PCR) or by microarrays. How genetic polymorphisms are related to each other within genomes? Haplotypes and Linkage Disequilibrium (LD), definitions. The history of the human migrations, the concept of LD blocks. We are patchwork of ancestral chromosomes. Calculation of the LD force between two polymorphisms using parameters D and r2.	Diapositive 3	.REC.
21/10	GIOV	8.30-10	Polo San Rossore Aula D1	2	12	The forces that shape haplotypic variability and modulate the intensity of the linkage disequilibrium. Molecular and non-molecular methods to define a haplotype. The HAPMAP project (www.hapmap.org). The haplotype-tagging SNPs. A visual example. Why we do not need to genotype all the polymorphisms in the genome.		.REC.	Link al primo Progetto di studio degli aplotipi umani (HapMap).
22/10	Ven	8.30-10	Polo Nobili Aula B	2	14	The database HaploReg, listing SNPs with their reciprocal LD. A practical use of the SNP arrays for detecting deletions/duplications in genomes. The example of the Duchenne’s Muscolar Distrophy. From the early probes (southern blot), to the microsatellites, MLPA analysis and SNP arrays. Use of SNP arrays for mapping inherited and de novo deletions in probands affected by mendelian/oligogenic traits. Combination of different patients with the same phenotype for refining the minimal critical region for a disease.	Diapositive 4	.REC.	Link a HaploReg.
28/10	GIOV	8.30-10	Polo San Rossore Aula D1	2	16	More examples on deletions detected by SNP arrays. Introduction to the linkage analysis for mapping mendelian traits. History (Huntington Disease). The information content of a polymorphism (PIC) and the heterozygosity as proxy for PIC. Why this parameter is important for linkage studies. Detecting recombinant kindreds for calculating the LOD scores in dominant traits. Example of the calculation of a LOD score in two families. The multipoint lod score (MLS). Introduction to the linkage analysis for recessive traits.		.REC.
29/10	Ven	8.30-10	Polo Nobili Aula B	2	18	Autozygosity mapping exploiting the segments of identity by descent (IBD) in families. Example of the mapping of the gene for cystic fibrosis exploiting the IBD segments at population level.		.REC.
4/11	GIOV	8.30-10	Polo San Rossore Aula D1			Questa lezione sara’ tenuta dal Prof. Roberto Marangoni
5/11	Ven	8.30-10	Polo Nobili Aula B			Questa lezione sara’ tenuta dal Prof. Roberto Marangoni
9/11	MaR	15.30-17.30	Aula H, Polo Fibonacci Edificio C	2	20	Introduction to Next Generation Sequencing. The reaction of pyrosequencing and the 454 system. 454/GS_FLX – emulsion-based PCR. Ion Torrent. Illumina®, the bridge amplification and the sequencing by synthesis.	Diapositive 5	.REC.	You can download video explicative of NGS here (it needs Winrar or Winzip: Videoclips)
11/11	GIOV	8.30-10	Polo San Rossore Aula D1	2	22	Single-molecule NGS methods: Oxford Nanopore and Pacific-Biosciences. Applications: whole genome sequencing (WGS), whole-Exome sequencing (WES), RNA sequencing (RNA-seq). Graphic illustration of the mapping of the "reads" in a genome browser. Irregular coverage of the genome. Relationship between "depth" and non-sequenced genome fraction. Relationship between number of reads and fraction of the non-sequenced genome. Relationship between depth and coverage. Relationship between depth and number of "genetic variations" detectable in a genome.		.REC.

12/11	Ven	8.30-10	Polo Nobili Aula B			Questa lezione non sara’ tenuta
18/11	GIOV	8.30-10	Polo San Rossore Aula D1	2	24	Possible "quantitative" use of RNA-seq. RNA-seq for the detection of mRNA isoforms. NGS to detect CNVs. The 1000Genomes, ExAC and GnomAD projects. The NHLBI project exome sequencing project. Example of mapping for autozygosity using NGS. Exome sequencing vs whole genome sequencing. What information can we understand? The ENCODE project.

PROGRAMMA SVOLTO PER L’ANNO 2020-2021

Ore cumulate	Argomento	SLIDES	AUDIO VIDEO RECORDINGS	Link interattivi

2	Introduction to the course. Refreshing the basics of Genetics	Diapositive 1	.REC.
4	Types of polymorphisms in the genomes. Minisatellites, microsatellites. DNA fingerprinting, Instability of microsatellites. The Slippage-misalignment model.	Diapositive 2	.REC.
6	Neurodisorders caused by aberrant expansion of triplet microsatellites. SNPs e INS/DELs. Discovery methods: Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP). High-resolution melting (HRM). Sanger’s sequencing reaction. Genotyping: DOT BLOT.		.REC.
8	Genotyping by RFLP (restriction fragment length polymorphism) e PCR-RFLP, ASO-PCR (o ARMS-PCR), OLA (Oligonucleotide Ligation Assay), MALDI-TOF, TaqMan Allelic Discrimination Assay. Microarrays for genotyping: the Single Base Extension (general principle). Illumina® BeadArray.		.REC.	Video on Real Time qPCR.
10	Microarrays for genotyping: hybridization with Affymetrix A short tour in dbSNPs, gnomAD, UCSC Genome Browser, the most used databases for browsing the genetics variations.		.REC.	Link a dbSNP, gnomAD, e UCSC Genome Browser
12	Segmental Duplications. Mandatory and optional. Mechanisms of formation: unequal crossing-over, whole-genome duplications. chromosomal rearrangements. The loci of CYP2D6 as an example of mandatory and polymorphic duplications and interstitial deletions in the human genome. The example of CYP2D6 in the metabolism of antidepressants and other drugs.		.REC.
14	The loci of GSTM1, GSTT1, and TP53 as example of mandatory and polymorphic duplications and interstitial deletions in the human genome. Genotyping of polymorphic interstitial deletions and small insertions by gel electrophoresis of PCR products. Analysis by Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (also called Multiplex Oligonucleotide Ligation Assay), analysis by TaqMan assay (Real-time quantitative PCR). How polymorphisms are related each other within genomes? Haplotypes and Linkage Disequilibrium (LD), definitions. The history of the human migrations, the concept of LD blocks. We are patchwork of ancestral chromosomes.	Diapositive 3	.REC.
16	Calculation of the LD force between two polymorphisms using parameters D and r2. The forces that shape haplotypic variability and modulate the intensity of the linkage disequilibrium. Molecular and non-molecular methods to define a haplotype. The HAPMAP project (www.hapmap.org).		.REC.	Link al primo Progetto di studio degli aplotipi umani (HapMap).
18	The haplotype-tagging SNPs. A visual example. Why we do not need to genotype all the polymorphisms in the genome. The database HaploReg, listing SNPs with their reciprocal LD. A practical use of the SNP arrays for detecting deletions/duplications in genomes. The example of the Duchenne’s Muscolar Distrophy. From the early probes (southern blot), to the microsatellites, MLPA analysis and SNP arrays. Use of SNP arrays for mapping inherited and de novo deletions in probands affected by mendelian/oligogenic traits. Combination of different patients with the same phenotype for refining the minimal critical region for a disease.	Diapositive 4	.REC.	Link a HaploReg.
20	More examples on deletions detected by SNP arrays. Introduction to the linkage analysis for mapping mendelian traits. History (Huntington Disease). The information content of a polymorphism (PIC) and the heterozygosity as proxy for PIC. Why this parameter is important for linkage studies. Detecting recombinant kindreds for calculating the LOD scores in dominant traits. Example of the calculation of a LOD score in two families. The multipoint lod score (MLS). Introduction to the linkage analysis for recessive traits.		.REC.
22	Autozygosity mapping exploiting the segments of identity by descent (IBD) in families. Example of the mapping of the gene for cystic fibrosis exploiting the IBD segments at population level. Introduction to Next Generation Sequencing. The reaction of pyrosequencing and the 454 system.	Diapositive 5	.REC.	You can download video explicative of NGS here (it needs Winrar or Winzip: Videoclips)
24	454/GS_FLX – emulsion-based PCR. Ion Torrent. Illumina®, the bridge amplification and the sequencing by synthesis. Single-molecule NGS methods: Oxford Nanopore and Pacific-Biosciences. Applications: whole genome sequencing (WGS), whole-Exome sequencing (WES), RNA sequencing (RNA-seq). Graphic illustration of the mapping of the "reads" in a genome browser. Irregular coverage of the genome. Relationship between "depth" and non-sequenced genome fraction. Relationship between number of reads and fraction of the non-sequenced genome. Relationship between depth and coverage. Relationship between depth and number of "genetic variations" detectable in a genome. Possible "quantitative" use of RNA-seq. RNA-seq for the detection of mRNA isoforms. NGS to detect CNVs. The 1000Genomes, ExAC and GnomAD projects. The NHLBI project exome sequencing project. Example of mapping for autozygosity using NGS. Exome sequencing vs whole genome sequencing. What information can we understand? The ENCODE project.		.REC.

Vecchi argomenti, non piu’ in uso.

Analysis by the “Comparative Genomic Hybridization” (Classical CGH). BAC arrayCGH, tiling BAC arrayCGH

SNP array CGH. Detection of mandatory or optional interstitial deletions/duplications. Special types of polymorphisms: the interstitial inversions. The example of 900Kbps inversion polymorphisms within 17q21.31 and susceptibility to mental retardation. The forces shaping allele frequencies in populations.

Mapping mendelian traits. The first example: Duchenne’s Muscolar Dystrophy. Cloning by subtraction (Kunkel’s method). Examples of genes causative for various types of neurological disorders detected by SNP-arrays in micro-interstitial deletions (these could be both inherited or de novo).

More on CGH-SNP-assarys. Detecting the minimal overlapping region for narrowing the region of interest associated with de novo or inherited conditions. Linkage analysis. Principles. DOMINANT AUTOSOMAL TRAITS. The first example of “linkage analysis” (related to Huntigton Disease). The information content of a polymorphism. Example of the calculation of the LOD score in two families and use of the LOD score for locating the genomic region associated (carrying) the disease-gene.

Multipoint LOD scores (MLS). RECESSIVE AUTOSOMAL TRAITS. Mapping homozygosity traits exploiting the autozygosity mapping. Chromosomal segments “Identical by Descent” (IBD). The “Identity by State” (IBS). Example of calculation of a LOD score in the offspring of second cousins. Candidate region identified with autozygosity mapping. Narrowing the candidate region exploiting a common ancestor in closed populations. Specific examples (cystic fibrosis, Nijmegen Breakage Syndrome, literature, see slides). Fine mapping in pedegrees (dominant model, an example).

Linkage analysis in animal models. Identification of the candidate region by the use of ENU-mutagenized mice. Mice helping to discover the gene for human diseases: the examples of Waardenburg syndrome, and mice shaker-2. The basics of the positional cloning. Pitfalls in linkage studies. After the human genome project: gene predictions, prioritizing genes for mutation scan. The examples of Retinitis pigmentosa, marfan syndrome, Beals’s syndrome, Wilson’s disease, Menkes’s disease. Mutation screening of exons or cDNAs? The example of Haemophilia Factor VIII. Possible landscapes following mutation screening: 1) Good correspondence between genotype and phenotype. Carriers/homozygotes must show the phenotype, healthy people within family should not be carriers or homozygotes. 2) Verify if the variant is a simple polymorphism (Genebank).

Mapping disease-genes in the era of Next Generation Sequencing. Strategies of sequencing. Hierarchical sequencing versus Shotgun sequencing. NGS Solexa-Illumina method. Ion Torrent. Single-molecule NGS methods: Pacific-Biosciences and Helicos Biosciences. Outline of NGS analysis: whole genome sequencing (WGS), Exome sequencing, RNA sequencing (RNA-seq). Hierarchical sequencing versus Shotgun sequencing. Outline of NGS analysis: whole genome sequencing (WGS), Exome sequencing, RNA sequencing (RNA-seq). Parallel massive sequencing applied in autozigosity mapping or for autosomal dominant diseases. Graphic illustration of the mapping of the "reads" in a genome browser. Irregular coverage of the genome. Relationship between "depth" and non-sequenced genome fraction. Relationship between number of reads and fraction of the non-sequenced genome. Relationship between depth and coverage. Relationship between depth and number of "genetic variations" detectable in a genome. Possible "quantitative" use of RNA-seq. RNA-seq for the detection of mRNA isoforms. NGS to detect CNVs. The 1000Genomes project. The NHLBI project exome sequencing project. Example of mapping for autozygosity using NGS. Exome sequencing and Whole genome sequencing. What information can we understand? The ENCODE project. Complex traits (non mendelian diseases).

Introduction to case-control association studies. Hypothesis-driven case-control studies. Selection bias. Stratification bias.

The error alpha (type-I error). The error beta (power of the study). Calculation of the Odd Ratio and the 95% confidence intervals. Examples of the genetics models (linear, dominant, recessive). From candidate genes (hypothesis driven studies) to genome-wide associations studies (GWAS, hypothesis generating studies). The Manhattan plots. The problems with multiple testing: the Bonferroni’s correction. A multistep design for a powerful and cost-effective GWAS. The correct interpretations of the results

How human genome is organized. Satellite DNA, Sat I, II, III, alphoid sequences, beta-sau, organization of centromeric heterochromatin, G and Q bands. Telomeric Minisatellites, multicopy genes (functional RNAs, duplicated genes, pseudogenes, processed pseudogenes). Retrotransposons: LINEs (LINE-1), SINEs (Alu dimer), Endogenous retroviruses, virus-like elements. Mechanisms of retro-transposition. DNA transposons. Mechanism of transposition with and without transposon duplication

Programma anni precedenti al 2015.

Lezione del:	Time	Argomento	Link per le diapositive	Note
Martedi’ 27/9 11-13 Aula F (Ed.B) Polo Fibonacci in Via Buonarroti	2	Presentazione del corso. Libri di testi consigliati, illustrazione del programma e del sito internet ad esso collegato. La PCR. Introduzione sul principio di funzionamento. Visualizzazione del prodotto di PCR. Il disegno dei primers. La Tm dei primers. Multiplex PCR. La marcatura dei prodotti di PCR. Aggiunta di code al 5’.	Diapositive 1a Diapositive 1b Diapositive 1	Principio di funzionamento della PCR: Videoclip Capitolo 6. Pag. 213-217	Dispensa 1
Venerdi’ 30/9 11-13 Aula A1 (Ed.B) Polo Fibonacci in Via Buonarroti	4	La PCR asimmetrica. Il metodo diretto del sequenziamento di DNA (reazione di Sanger). La nested PCR. La semi-nested. La ASO-PCR. La PCR inversa. PCR hotstart. Touch-down PCR. RT-PCR. Long range PCR. Primers mutagenetici. Un esempio di mutagenesi sito-specifica con primers mutagenetici: il “QuickChange Lightning Site-Directed Mutagenesis”. Whole-genome amplification (WGA). DOP-PCR. Adaptor-ligation PCR. Inter-Alu PCR. Phi29 DNA-polymerase. La quantificazione dell’espressione genica. Il Northern Blot. La Real time quantitativa (qPCR). Molecular Beacons e Sonde Taqman Utilizzo delle giunzioni esone-esone per il posizionamento dei primers in qPCR.	Diapositive 2	Link per QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Link per WGA Phi-29 Link per Northern Blot	Dispensa 2 Dispensa 3
Martedi’ 04/10 11-13 Aula F (Ed.B) Polo Fibonacci in Via Buonarroti	6	Ultime considerazioni: 1) i primers devono essere unici, verificati con BLAST 2) Origine di contaminazione delle PCR Calcolo della quantita’ di espressione con metodo qPCR. Quantificazione relativa e assoluta (metodo del DeltaDelta-Ct, approssimato). Esempio di utilizzo di qPCR. Introduzione alla digital droplet PCR (ddPCR). Principio di funzionamento della ddPCR. Esempi di utilizzo. Aspetti matematici della ddPCR.		Capiitolo 7. Pag 238> Link per la misurazione dell’expression level Link per: Digital Droplet PCR VIDEO per ddPCR	Dispensa 4
Venerdi’ 07/10 11-13 Aula A1 (Ed.B) Polo Fibonacci in Via Buonarroti	8	I numeri notevoli dell’RNA. Micro-array per analisi di trascrittomica. Tipi di sonde: a cDNA, 65-mers e 25-mers. Metodo competitivo a due colori. Metodi a singolo colore. Sintesi di sonde nell’array Affymetrix (metodo di stampa fotolitografico). Cenni sul processamento dell’immagine: sottrazione del background. Normalizzazione dei dati (Z-score). Pittfalls: specificita’ delle sonde, condizioni di stringenza dell’ibridazione, strutture secondarie delle sonde, uniformita’ delle condizioni di ibridazione, retro-trascrizione dell’mRNA senza amplificazione (PCR) al fine di non distorcere il contenuto relativo dei trascritti.			Link per gli approfondimenti sul processamento dell’immagine Link verificato per approfondimento generale Link ancora piu’ approfondito
Martedi’ 11/10 11-13 Aula F (Ed.B) Polo Fibonacci in Via Buonarroti		ATTENZIONE: lezione non tenuta e recuperata il giorno successivo (Mercoledi’ 12/10)
Mercoledi’ 12/10 Ore 14-16 Polo Fibonacci in Via Buonarroti Aula D3	10	Cenni sui metodi di raggruppamento (hierarchical clustering) a due vie (per geni e per campioni). Esempi di applicazioni del gene profiling: lettura consigliata da Nature,403(6769):503-511. Tipologie di polimorfismi genetici. Frequenze alleliche, differenza tra mutazioni e polimorfismi. Clini di frequenze alleliche. Minisatelliti. Microsatelliti. Micro-insersioni. Micro-delezioni. Metodi di indagine dei minisatelliti. Metodi di indagine dei microsatelliti. DNA fingerprinting. DNA profiling in genetica forense. Evoluzione delle sequenze ripetute in tandem (mini e micro satelliti). Micro-satellite instability. Slippage-misalignment.	Diapositive 3		Dispensa 5
Venerdi’ 14/10 11-13 Aula A1 (Ed.B) Polo Fibonacci in Via Buonarroti	12	Polimorfismi a singolo nucleotide, micro-insersioni, micro-delezioni. Metodi di rilevamento (discovery e genotyping). Reazione di sequenziamento di Sanger. Rilevazione di mutazioni tramite dHPLC. Single strand conformation polymorphisms (SSCP). Genotipizzazione mediante PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism), ASO-PCR/ARMS (amplification refractory mutation system), oligonucleotide ligation assay, MALDI-TOF, TaqMan Allelic Discrimination Assay, DOT-BLOT.			Dispensa 6a Dispensa 6b Dispensa 6c
Martedi’ 18/10 11-13 Aula PS1 Polo Fibonacci in Via Buonarroti	14	Gli array di genotipizzazione. Metodica Arrayed Primer Extension Assay (APEX). Genotipizzazione tramite Illumina BeadArray. Il Bead decoding. Genotipizzazione tramite Affymetrix GeneChip. Il pattern delle sonde MM e PM. Le duplicazioni segmentali. Definizione. Duplicazioni segmentali constitutive Evoluzione tramite duplicazione di intero genoma, crossing-over ineguale e riarrangiamento cromosomico. Pseudogeni. Esempi di delezioni e duplicazioni polimorfiche: CYP2D6, GSTM1, GSTT1. Metodi per rilevare delezioni/duplicazioni segmentali polimorfiche o mutanti. TaqMan, MLPA, analisi delle delezioni nella DMD nei maschi. Comparative Genomic Hybridization (Classical CGH). BAC arrayCGH, tiling BAC arrayCGH.	Diapositive 4		Dispensa 7 Dispensa 8 (link verificato per CGH e array-CGH)
Venerdi’ 21/10 11-13 Aula PS1 Polo Fibonacci in Via Buonarroti	16	SNP array per CGH. Le inversioni segmentali. Un polimorfismo di inversione in 17q21.31 Le principali forze che modellano le frequenze alleliche nelle popolazioni.		Inversione polimorfica (link utile)	Dispensa 9 (link verificato per SNP array-CGH) Dispensa 9b (Ancora materiale su SNP array per analisi delle CNV)
Martedi’ 25/10 11-13 Aula PS1 Polo Fibonacci in Via Buonarroti	18	Digital Droplet PCR e biopsie liquide. Applicazioni per ricerca di rare copie di DNA mutante entro miscela di DNA wild-type. Organizzazione del genoma e altre sequenze ripetute: Il DNA satellite, l’eterocromatina centromerica, bandeggio cromosomico (G e Q). Il DNA minisatellite telomerico, “protein coding-genes” multicopia, geni duplicati, geni multicopia degli RNA (tRNA, rRNA, snoRNA, snRNA, miRNA), retro-trasposoni (LINE-1, LINEs). Meccanismo di retrotrasposizione delle LINEs.	Diapositive 5 Diapositive 6		Diapositive originali sulle applicazioni della ddPCR. A cura della Dottoressa Marzia Del Re (Farmacologia) Diapositive Del RE Dispensa 10 (link verificato per il DNA altamente ripetuto)
Venerdi’ 28/10 11-13 Aula PS1 Polo Fibonacci in Via Buonarroti	20	Le SINEs (la sequenza Alu), Pseudogeni processati, virus-like elements (retro-trasposoni LTR), trasposoni a DNA e meccanismo di trasposizione. Dal fenotipo al gene. I tratti mendeliani. Step 1a: identificazione della regione candidata tramite osservazioni citogenetiche (Esempio: Distrofia muscolare di Duchenne e clonaggio per sottrazione di Kunkel). Casi di patologie “de novo” ed analisi di delezioni interstiziali con metodiche ad alta risoluzione (SNP array).	Diapositive 7	Dal fenotipo al gene: Capitoli 14, 15 e 16 dello Strachan.	Lettura consigliata sulle “SINE” (Alu) Dispensa 10b (da pag 263 l’argomento e’ trattato in maniera molto ricca e puo’ servire per approfondire quanto visto a lezione) Dispensa 10c: Il DNA satellite (link verificato) Dispensa 11
Venerdi’ 04/11 11-13 Aula PS1 Polo Fibonacci in Via Buonarroti	22	Esempi di patologie legate a delezioni interstiziali di un singolo gene o di pochi geni. Step 1b: Identificazione della regione candidata tramite analisi di linkage. Primo esempio di Analisi di linkage: la Corea di Huntington. Misurare il “contenuto di informazione di un marcatore genetico” (PIC) tramite calcolo della eterozigosita’.
Martedi’ 08/11 11-13 Aula PS1 Polo Fibonacci in Via Buonarroti	24	Esempi di alberi geneaologici dove capire la “fase gametica” e la prole “ricombinante” e “parentale”. Calcolo del LOD SCORE (mappatura a due punti).			Link verificato per “Analisi di Linkage”
Mercoledi’ 9/11 Ore 14-16 Polo Fibonacci in Via Buonarroti Aula D3	26	Da un singolo marcatore a piu’ marcatori. Il multipoint LOD score. La prima mappa con densita’ elevate dei marcatori umani (CHLC, CEPH). Il multipoint LOD score. La mappatura per i tratti recessive sfruttando l’autozigosita’. Segmenti cromosomici con “Identity by Descent” (IBD) rispetto alle omozigosita’ di segmenti cromosomici con “Identity by State” (IBS). Esempio di calcolo di LOD score in figli di secondi cugini. Relazione tra numero di generazioni e segmenti IBD. Relazione tra densita’ dei marcatori e capacita’ di rilevare i segmenti IBD. Esempio della mappatura del gene della Fibrosi cistica sfruttando gli aplotipi ancestrali. Aplotipi ancestrali e Linkage disequilibrium nella mappatura della Fibrosi Cistica.	Lezione AUDIO per gli assenti.	(Pag 529 del testo, riguardo alla mappatura per autozigosi)	Dispensa 12
Venerdi’ 11/11 11-13 Aula PS1 Polo Fibonacci in Via Buonarroti	28	Riassunto della lezione precedente (multipoint LOD score). Regione candidata identificata tramite mappatura per autozigosita’. IBD e IBS. Possibilita’ di restringere la regione candidata sfruttando l’ancestore comune (esempio della fibrosi cistica e della Nijmegen Breakage Syndrome) in popolazioni chiuse. Esempi dalla letteratura di mappature per autozigosita’ (vedere diapositive). Esempio di fine mapping in alberi geneaologici (dominanza e recessivita’).
Martedi’ 15/11 11-13 Aula I1 EDIFICIO B Polo Fibonacci in Via Buonarroti	30	Identificazione della regione candidata tramite l’uso di animali modello. ENU-mutagenized mice. Cenni sul clonaggio posizionale, ordinamento dei contigui di cloni e predizione dei loci genici. L’era post-genomica: uso delle banche dati per l’identificazione dei geni nella regione candidata. Quali dei geni della regione candidate sono da sottoporre a screening di mutazione? Prioritizzazione sulla base del pattern di espressione, della funzione, delle informazioni provenienti da ortologhi e paraloghi. Esempi: Retinite pigmentosa, Sindrome di Marfan, Sindrome di Beals, Malattia di Wilson e Malattia di Menkes. Prioritizzazione possibile anche sulla base di predizioni strutturali della proteina (domini funzionali). Prioritizzazione sulla base di informazioni parziali dei domini proteici. Sequenziamento degli esoni dei geni prioritizzati, ma non solo: il cDNA. Esempi della fibrosi cistica e dell’emofilia grave (fattore VIII). Verifiche all’ipotesi che le mutazioni riscontrate in un probando siano effettivamente causative della patologia: la corrispondenza del modello genetico con la segregazione della mutazione; mutazioni o polimorfismi?		(Cap. 20, pag 767 per alcuni cenni sui topi mutagenizzati con ENU)	Dispensa 13
Venerdi’ 18/11 11-13 Aula PS1 Polo Fibonacci in Via Buonarroti	32	Sequenziamento di probandi di famiglie diverse: cosa mi aspetto? Tre possibili situazioni (stessa mutazione, stesso gene diversa mutazione, nessuna mutazione). Inferire l’effetto funzionale della mutazione (predizione in silico). Esempi di patologie il cui gene e’ stato rinvenuto tramite clonaggio posizionale e esempi di patologie dove il gene candidato non era immediatamente prevedibile dalla funzione. The HGP (Human Genome Project). Metodo clone-by-clone, metodo “shotgun”. Il sequenziamento e il ri-sequenziamento dei genomi oggi: le metodiche di “Next generation sequencing” (NGS). Sistema “454” (Roche).	Diapositive 8	Videoclips	Dispensa 14
Martedi’ 22/11 11-13 Aula PS1 Polo Fibonacci in Via Buonarroti		Questa lezione non verra’ tenuta
Mercoledi’ 23/11 14-16 Aula D3 Polo Fibonacci in Via Buonarroti	34	L’importanza del “Depth” e del “Coverage”. Illustrazione grafica della mappatura delle “reads” in un genome browser. Coverage irregolare del genoma. Relazione tra “depth” e frazione di genoma non sequenziato. Relazione tra numero di reads e frazione del genoma non sequenziato. Relazione tra Depth e Coverage. Relazione tra Depth e numero di “variazioni genetiche” rilevabili in un genoma. Metodo NGS Solexa-Illumina. Ion-Torrent. Metodi NGS su singola molecola: Pacific-Biosciences e Helicos Biosciences. Cenni sulle applicazioni dell’NGS: whole genome sequencing (WGS), Exome sequencing, RNA sequencing (RNA-seq). Possibile utilizzo “quantitativo” dell’RNA-seq.
Venerdi’ 25/11 11-13 Aula PS1 Polo Fibonacci in Via Buonarroti		Questa lezione non verra’ tenuta
Martedi’ 29/11 11-13 Aula PS1 Polo Fibonacci in Via Buonarroti	36	NGS: qualità delle reads. RNA-seq per l’individuazione delle isoforme degli mRNA. NGS per rilevare le CNV. Il progetto 1000Genomes. Il progetto NHLBI exome sequencing project. Esempio di mappatura per autozigosità mediante NGS. Exome sequencing e Whole genome sequencing. Quali informazioni possiamo capire? Il progetto ENCODE.
Venerdi’ 02/12 11-13 Aula PS1 Polo Fibonacci in Via Buonarroti	38	Gli studi di associazione caso-controllo per lo studio dei tratti multifattoriali. Studi guidati da una ipotesi: scelta del gene e scelta del polimorfismo. Come scegliere i casi, come scegliere i controlli. Esempi di “bias” (“recall bias”, “selection bias”, “stratification bias”). Errori con l’uso della prevalenza invece che dell’incidenza. Stratificazioni della popolazione. Errori nel campionamento dei controlli.	Diapositive 9		Dispensa 15
Martedi’ 06/12 11-13 Aula PS1 Polo Fibonacci in Via Buonarroti	40	Calcolo del rischio tramite stima dell’OR (Odd Ratio) e dei suoi intervalli di confidenza. Possibili modelli di “trend’ del rischio: co-dominanza, recessivita’, dominanza. Limiti degli studi di associazione. La meta-analisi come strumento statistico. Saper interpretare uno studio caso-controllo: associazione non vuol dire causa; l’importanza di sapere il significato dell’errore di tipo I (alpha). ApoE4 come esempio di variante allelica associata a patologia umana.
Venerdi’ 09/12 11-13 Aula PS1 Polo Fibonacci in Via Buonarroti		Questa lezione non verra’ tenuta
Martedi’ 13/12 11-13 Aula PS1 Polo Fibonacci in Via Buonarroti	42	Scelta degli SNPs da genotipizzare in uno studio di associazione guidato da ipotesi (entro un gene candidato). Utilizzo del linkage disequilibrium. Calcolo della forza di LD tra due polimorfismi tramite i parametri D e r². Le forze che plasmano la variabilita’ aplotipica e modulano l’intensita’ del linkage disequilibrium. Metodi molecolari e non per definire un aplotipo. Il progetto HAPMAP (www.hapmap.org). Come estrarre gli haplotype-tagging SNPs.	Diapositive 10		Dispensa 16
Mercoledi’ 14/12 14-15 Aula D3 Polo Fibonacci in Via Buonarroti		LEZIONE DI RECUPERO MI SCUSO PUBBLICAMENTE. HO DIMENTICATO DI SEGNARE IN AGENDA LA LEZIONE DI RECUPERO E NON HO RICEVUTO AVVISI CHE MI RICORDASSERO DI QUESTO APPUNTAMENTO.
Venerdi’ 16/12 11-13 Aula PS1 Polo Fibonacci in Via Buonarroti	44	Dai geni candidate (hypothesis driven studies) ai genome-wide associations studies (GWAS, hypothesis generating studies). I Manhattan plot. Esempio di GWAS ad identificare locus di suscettibilita’ al cancro, nella regione 8q24.	Diapositive 11		Dispensa 17: "Closing the Net on Common Disease Genes"
Martedi’ 20/12 11-13 Aula I1 Polo Fibonacci in Via Buonarroti	46	Lezione di riepilogo con illustrazione di temi d’esame degli anni passati
Questa lezione si tiene Mercoledi’ 21 alle 14 nell’aula del piano 3 di Via Derna 1.	48	Lezione di riepilogo con illustrazione di temi d’esame degli anni passati

		Link di possibile interesse:
		Banche dati: Genome Browser della UCSC, dbSNP e 1000Genomes		http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway http://www.1000genomes.org/ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/
		Seminario intitolato: “NEXT GENERATION SEQUENCING- ION TORRENT: APPLICAZIONI IN AMBITO MICROBIOLOGICO E VIROLOGICO”		VIDEO 1 VIDEO 2